作品來源：admin 發布時間：2020-04-02 16:41
目次
前言
1． 范圍
2． 引用標準
3． 定義
4． 進行厭氧菌敏感試驗的指征
5． 厭氧菌敏感試驗的局限性
6． 抗微生物藥
7． 常規試驗和報告中抗微生物藥的選擇
8． 稀釋試驗接種物制備
9． 參考瓊脂稀釋法（Wadsworth法）
10. 微量肉湯稀釋法
11.β-內酰胺酶試驗
12. 質量控制的方法
附錄：培養基和補充劑的制備
表1：厭氧菌試驗應考慮的抗微生物藥推薦分組
表2：解釋標準和相對應最低抑菌濃度（MIC）值
表3：制備抗微生物藥貯存液需要的溶劑和稀釋液
表4：瓊脂稀釋法或微量肉湯稀釋法敏感試驗中抗微生物藥稀釋液的制備方案
表5：參比瓊脂稀釋試驗標質控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質控允許范圍
表6：微量肉湯稀釋試驗質控菌株的最低抑菌濃度（MIC）的質控允許范圍
前言
臨床細菌分離中由于厭氧菌感染日漸增多，厭氧菌的藥敏試驗和耐藥監測已提到日程上。本標準是在衛生部頒發的《全國臨床檢驗操作規程》（第三版）的基礎上，依據美國國家臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards,NCCLS）M11-A5文件－厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗方法（已批準的標準－第五版）[ISBN 1-56238-429-5]，結合中國國情及衛生系統的實際情況和要求制定。
本標準從2004年 月 日起實施。
本標準由衛生部提出。
本標準起草單位：北京大學人民醫院檢驗科。
本標準主要起草人：張正 岳志紅。
本標準由衛生部委托衛生部臨床檢驗中心負責解釋。
中華人民共和國衛生行業標準
WS/T×××-200×
厭氧菌的抗微生物藥敏感試驗方法
Methods for Antimicrobial Susceptibility
Testing of Anaerobic Bacteria
1. 范圍
本文件所述方法主要用于測試普通分離到的厭氧菌。瓊脂稀釋法可用于測試大多數厭氧病原菌。目前微量肉湯稀釋法僅用于測試脆弱擬桿菌菌群的病原菌。本標準適用于從事厭氧菌抗微生物藥敏感試驗的臨床實驗室使用。
2. 引用標準
下列標準條文主要根據美國NCCLS的M11-A5文件和中華人民共和國衛生部醫政司編制的《全國臨床檢驗操作規程》（第三版）而制定。
3. 定義
3.1瓊脂稀釋敏感試驗
將某一種抗微生物藥的系列濃度混入用于敏感試驗的瓊脂生長培養基進行的抗微生物藥敏感試驗。
3.2敏感
指該菌株所致感染可以用推薦用于此型感染及病原菌的抗微生物藥劑量進行恰當地治療。
3.3中介
藥物在生理濃集的部位具有臨床效力或者可用高于正常劑量的藥物進行治療；此還包括一個“緩沖區”可以防止微小的，未能控制的技術因素造成重大的結果解釋錯誤。
3.4 耐藥
指常規劑量抗微生物藥通常達到的濃度不能抑制該菌株的生長和/或該菌株的MIC落于某范圍內。在此范圍內，可存在某些特定的耐藥機制（如β-內酰胺酶類），并且治療研究顯示其臨床療效并不可靠。
3.5最小抑菌濃度
瓊脂或肉湯稀釋敏感試驗中抗微生物藥抑制某一種微生物可見生長的最低濃度。
4. 進行厭氧菌敏感試驗的指征
臨床上有厭氧菌感染存在，并在實驗室分離出厭氧菌，原則上均應進行抗微生物藥敏感試驗。
4.1 常規試驗
從腦膿腫、心內膜炎、骨髓炎、關節感染、人工裝置或人工血管感染和菌血癥分離到的特殊感染的標本應該測試，并應參考臨床醫生的合理建議。
當感染的性質不清楚，標本含有內源性厭氧菌菌群，而且病原菌與正在治療的感染關系很少時，通常不必做敏感試驗。當存在多種厭氧菌時，參考臨床情況選擇可能引起厭氧菌感染的最重要菌種進行敏感試驗。一般分離到擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬。梭菌屬、嗜膽菌屬和薩頓氏菌屬的一些菌種應做敏感試驗。
敏感試驗應使用分純后菌懸液。不能直接用臨床標本進行敏感試驗。MIC試驗一般采用倍比稀釋，采用本標準推薦方法，做好質控，結果報告采用在實際終點時的一個倍比稀釋范圍內較為科學。例如：終點為16μg/mL，真正報告應8μg/ml-32μg/ml范圍更好。并做出敏感、中介或耐藥判斷，以供臨床參考。
4.2 監測試驗
當技術條件不允許每個實驗室都進行厭氧菌敏感試驗時，建議當地建立參考實驗室，收集一定量臨床菌株（不少于50-100株），集中測試后公布結果供大家參考。
5. 厭氧菌敏感試驗的局限性
體外結果不足以預測某個病人對厭氧菌感染治療的反應，僅供臨床選藥參考。此標準的試驗方法也并不一定適用于所有的厭氧菌，以下2點需考慮。
5.1 折點和臨床相關
關于確定厭氧菌對大多數抗微生物藥的敏感性的折點，現在并無一致意見。目前折點的確定是基于動物模型或需氧和厭氧菌多重感染的病人的臨床試驗結果。因為大多數厭氧菌感染發生于密閉空間，涉及多種微生物，單一抗微生物藥抗單一微生物的體外活性并不直接與其體內效力相關。
除數目分布和臨床效力之外，MIC結果的敏感和中介折點解釋是基于最大的推薦劑量獲得的血清水平，因為厭氧菌感染通常推薦最大劑量用藥。建立中介范圍是因為有些藥物難于判讀終點和MIC在折點附近聚集。
5.2 病原菌
瓊脂稀釋法適用于測試多種不同的厭氧菌。至今為止，微量肉湯稀釋法僅限于測試脆弱擬桿菌菌群。當測試菌呈蔓延生長時（例如艱難梭菌或破傷風梭菌），則需要盡量在瓊脂平板上劃開接種物。而對于敗毒梭菌，每個平板只能測試一個分離株。
6. 抗微生物藥
6.1 來源
抗微生物藥標準品或參考藥品可直接來自廠商，或來自中國藥品及食品監督管理局檢定所，或其他商業途徑。不應把非腸道的制品用于敏感試驗?？山邮艿乃幤窇N有標簽，標明藥品的通用名，批號，分析活力（常用每mg藥品中含μg或國際單位（IU）表示）和有效期。貯存于規定的溫度和濕度中。用時防止冷凝水進入。
6.2 抗微生物藥的稱量
實驗室必須根據該批待用藥品的分析結果來標化其抗微生物藥溶液?？刮⑸锼幤窇褂媒浻嬃空J證的分析天平稱量。公式如下：
重量(mg)=體積（mL）×所需濃度（μg/mL）
分析活力（μg/mg）
或
體積（mL）=重量(mg) ×分析活力（μg/mg）
所需濃度（μg/mL）
6.3 制備貯存液
抗微生物藥貯存液制備的濃度一般應該至少為1,000μg/mL(如1,280μg/mL)或者是最高測試濃度的10倍。某些藥物必須溶解于非水溶劑中。此時，應使用盡量少的溶劑來溶解抗微生物藥。最終的貯存液可用水或表3所述的合適的稀釋劑進行稀釋。貯存液分裝后貯存于規定溫度下，一般-60℃可保存半年。
6.4 測試濃度的數目
一種特定抗微生物藥的測試濃度應包含表2所示的解釋性折點，但實測的濃度數目是由實驗室決定的。MIC結果報告推薦選用五個或更多濃度。建議選用的范圍應包涵質控菌株的在控數值。
7. 常規試驗和報告中抗微生物藥的選擇
敏感試驗抗微生物藥品種類選擇可參考表1。在實際應用中，應結合我國實情，參考實驗室所在的臨床單位醫生及控感科意見做出合適選擇，不斷積累經驗。
完整的報告單應包括患者一般資料（姓名、性別、年齡和病理號等）。藥品名稱應按照我國藥典頒布名稱。菌種名稱按照衛生部已公布名詞標準。應報告敏感、中介和耐藥。
8. 稀釋試驗接種物制備
受試菌應是從強化布氏血瓊脂選擇經充足時間孵育（24-48小時）產生的合適大小的菌落。菌落直徑通常至少1毫米?？焖偕L菌如脆弱擬桿菌菌群和產氣莢膜梭菌可經24小時孵育后測試，而其它大多數厭氧菌需要48小時孵育。對于緩慢生長的厭氧菌，如嗜膽菌屬和纖細彎曲桿菌，可以從多個瓊脂平板制備接種物以保證標準化的準確?？赏ㄟ^生長法或直接菌落懸液法制備接種物。
8.1 制備接種物時的濁度標準
為使敏感試驗的接種濃度標準化，應使用一個等同于0.5號麥氏（McFarland）標準管的BaSO4濁度標準管或其光學等同物（如乳膠顆粒懸液）。BaSO4的0.5號麥氏標準管制備見附錄。
8.2分離株的貯存和復蘇
8.2.1 冷凍
大多數厭氧菌可在20％甘油中在-60℃或更低溫度保存數年。將四份48小時肉湯培養物轉移到含有一份無菌甘油的無菌玻璃瓶中。充分混勻成均一懸液后冷凍。預還原時使用不加糖的皰肉培養基。
另外，也可將48小時平板培養的若干菌落直接懸浮于20％滅菌脫脂牛奶中，-60℃冷凍。
8.2.2 復蘇
凍存的分離株必須在強化布氏血瓊脂上至少傳代兩次，用于敏感試驗前必須證明其純度。
8.3 生長法
（1） 從強化布氏血瓊脂選擇經24小時或充足時間孵育產生的合適大小的菌落（直徑至少1毫米）。挑取形態特征完全一致的至少5個菌落，或用3mm直徑的接種環取滿一環，接種于無指示劑的硫代硫酸鹽培養基。如果此步驟使用厭氧箱，可使用強化布氏肉湯，強化腦心浸液或Schaedler氏肉湯替代硫代硫酸鹽肉湯。
（2） 孵育肉湯6-24小時或直至獲得足夠濁度。
（3） 加入布氏肉湯或其它使用前預還原或煮沸后冷卻的肉湯，調整濁度等于0.5號麥氏標準。對于大腸桿菌ATCC25922或脆弱擬桿菌ATCC25285，此時懸液中細菌數約為1-2×108CFU/mL。但應注意到不同厭氧菌分離株接種大小的變化。
8.4 直接菌落懸液法
（1） 此法是從孵育了24-48小時強化布氏血瓊脂平板挑取菌落。制備懸液時平板在有氧環境中不應超過30分鐘。
（2） 輕輕挑取形態特征完全一致的至少5個菌落，直接轉移到布氏肉湯或其它使用前預還原或煮沸后冷卻的肉湯，獲得相當于0.5麥氏標準的濁度。
（3） 此法制備厭氧菌的一些菌種菌懸液計數會輕度升高。
9. 參考瓊脂稀釋法（Wadsworth法）
9.1 試劑和材料
9.1.1 厭氧罐（箱）
采用環境含4-7％CO2厭氧罐（箱），并應有無氧狀態指示劑。
9.1.2 強化布氏瓊脂
使用的培養基是每mL布氏瓊脂中添加5μg氯化血紅素、1μg維生素K1和5％脫纖維羊血(v/v)。布氏瓊脂的組成和制備，補充劑的制備和添加詳見附錄。也可提前配制瓊脂，使用當天融化。制備抗微生物藥稀釋液后，抗微生物藥和脫纖維羊血一起加入到融化瓊脂中。
9.2 瓊脂稀釋平板的制備步驟
開始前，確定抗微生物藥及其所用濃度。制備瓊脂稀釋平板時，15×100圓形平板需要20mL瓊脂，方形平板需要30mL。平板的制備是將一份10×抗微生物藥溶液加入到九份瓊脂中。例如：制備20mL瓊脂的圓形平板，需要在17mL已添加氯化血紅素和維生素K1的融化的布氏瓊脂（保持在45℃-50℃）中加入1mL脫纖維羊血和2mL10×抗微生物藥溶液。方形平板則是25.5mL布氏瓊脂、1.5mL脫纖維羊血和3mL10×抗微生物藥溶液。
9.2.1 制備瓊脂空白
（1） 試驗前或試驗中，準備足夠已添加維生素K1和氯化血紅素的布氏瓊脂，分配合適的量到試管中。每種抗微生物藥的每個濃度準備一管。
（2） 如果試驗當天使用，分配后置于48℃-50℃水浴。如果提前制備，融化培養基（沸騰水浴，微波爐或高壓鍋），置于水?。?/span>48℃-50℃）中冷卻。
9.2.2 制備抗微生物藥稀釋液
（1） 融化以前制備的抗微生物藥貯存液，或試驗當天制備。
（2） 將設計好數量（見表4）的滅菌蒸餾水加入相應管中，制備稀釋液空白。
（3） 使用表4所述稀釋規則， 1:2，1:4，和1:8連續稀釋制備中間濃度（10×）抗微生物藥溶液，而不是直接倍比稀釋。此方法制備稀釋液可使稀釋錯誤最小化。
9.2.3 制備瓊脂稀釋平板
（1） 標記制備的每一種抗微生物藥的每一種濃度的平板，將平板置于水平臺面上。
（2） 對于制備的每一種抗微生物藥濃度，將1mL脫纖維羊血（對于方形平板1.5mL）和2mL10×抗微生物藥溶液（對于方形平板3mL）加入到17mL融化并冷卻的強化布氏瓊脂（對于方形平板25.5mL）試管中。蓋緊試管蓋子，輕輕翻轉數次混勻，小心不要產生氣泡。倒入平板，固化。
（3） 如果測試一種抗微生物藥，應準備另外四個不加抗微生物藥的平板，和以上（2）相同的步驟，但用滅菌蒸餾水替代抗微生物藥溶液。對于另外測試的每一種抗微生物藥，準備另外一個不加抗微生物藥的平板。
（4） 瓊脂固化后，可將平板蓋子半開置于層流罩或溫箱約30分鐘使其干燥?；蛘呤欠D平板將瓊脂底蓋支在蓋子上。
9.2.4 瓊脂稀釋平板的貯存
（1） 用于常規試驗，試驗前密封于塑料袋中于2℃-8℃貯存，不超過7天。
（2） 用于研究和評估目的，推薦貯存期不超過72小時。
（3） 含亞胺培南，克拉維酸或其它已知不穩定的β-內酰胺/β-內酰胺酶抑制劑組合的抗微生物藥的平板必須在試驗當天配制。
9.3 接種瓊脂稀釋平板
接種物接種到瓊脂表面的最簡便的方法是使用多點接種器取1-2μL接種到瓊脂表面。那么最終瓊脂上接種物每點接近105CFU。由于大多數厭氧菌能暫時容忍暴露于氧氣，所有操作可在外界環境中進行。一些苛養菌分離株則必需使用預還原平板和在厭氧環境中進行所有操作。
（1） 使微生物生長到濁度等于0.5號麥氏標準或將菌落直接制成懸液到相同濁度，制備標準化的接種物。
（2） 試管按順序排列在架子上，將少量體積（約0.5mL）移至多點接種器的相應孔中。在瓊脂平板上做標記，以標明接種點的方位。
（3） 小心避免飛濺。
（4） 順序：從最低到最高的藥物濃度依次接種。
（5） 質控：試驗開始時首先接種兩個無抗微生物藥的對照平板。其中一個平板標記“pre-O2”（檢查需氧菌污染），另外一個平板標記“pre-Ana”（厭氧菌最初生長對照）。每一系列平板之間，接種一個無抗微生物藥的對照平板做生長對照。最后，再次接種兩個平板，標記為“post-O2”和“post-Ana”，來證實最終病原菌生長力和純度。
9.4 孵育瓊脂稀釋平板
（1） 平板一旦變干，翻轉后置于厭氧罐或替代厭氧環境中35℃孵育42-48小時。
（2） 有氧孵育平板（證實有氧環境中未能生長）應置于含有5％CO2環境中35℃孵育42-48小時。
9.5 判讀瓊脂稀釋終點
（1） 在黑色不反光的背景下觀察每一平板。首先判讀對照平板，尋找需氧菌可能污染或孔間交叉污染。如果檢測到污染，則必需重新測試。
（2） 判讀MIC終點是和厭氧菌對照平板相比生長特征發生顯著抑制的測試平板的濃度。樣本的一個顯著生長變化包括薄霧狀、多個細小菌落，或一個到數個正常大小菌落。
10. 微量肉湯稀釋法
此法僅適用于測試脆弱擬桿菌菌群。
10.1 試劑和材料
10.1.1 厭氧罐（箱）
附錄所述瓊脂稀釋法條件同樣也適用于微量肉湯稀釋法。
10.1.2 強化布氏肉湯
布氏肉湯的組成和制備，補充劑的制備和添加詳見附錄。
10.2 微量肉湯稀釋板準備
（1） 本法被稱為“微量稀釋”是因為使用了小體積的肉湯。這些小體積肉湯被分配到無菌塑料微量稀釋板。每個小孔至少應裝0.1mL肉湯。
（2） 為制備（10×）抗微生物藥溶液，應將濃縮的抗微生物藥貯存液按表4所述內容進行稀釋或進行倍比稀釋。將一份10×抗微生物藥溶液加入到九份肉湯中，得到所需最終濃度。
（3） 制備微量稀釋板的最簡便方法是使用分配裝置。它可以用至少10mL肉湯制成的抗微生物藥稀釋液按照每孔0.1（±0.02）mL的量分配到標準的96孔中。
（4） 加完各種抗微生物藥稀釋液的微量稀釋板應使用塑料袋密封并立即置于冰箱<-20℃（最好<-60℃）貯存。某些藥物如克拉維酸和亞胺培南，必須貯存在-60℃以下。應防止反復凍融。
10.3 微量肉湯稀釋板的接種
使微生物生長到濁度等于0.5號麥氏標準或將菌落直接制成懸液得到相同濁度，制備標準化的接種物。
（1） 調整好的接種菌懸液最好在15分鐘內用水或鹽水稀釋，接種后每管或每孔大約含1×106CFU/mL。為獲得此最終接種物而采取的稀釋步驟，可因接種物加到單個孔的加樣方法不同而不同，因此對于每一種情況都必須進行計算。計算時必須知道微量稀釋試驗要加到孔內的接種物的確切體積。例如，如果孔內培養基體積是0.1mL，接種物體積為0.01mL,那么應將0.5號麥氏懸液（約1.5×108CFU/mL）按1:15稀釋以獲得1×107CFU/mL的菌液。當取0.01mL此菌液接種肉湯時，細菌的最終測試濃度為1×106CFU/mL(或1×105CFU/孔)。
（2） 按上述方法對接種物進行標準化后15分鐘內，可以用接種裝置取體積不超過小孔體積10％的接種物（如在0.1mL抗微生物藥液中接種物應≤10μL）接種微量稀釋板的每個孔。相反，如果用0.05mL的吸管，每孔的內容物將被1:2稀釋。
（3） 為菌落計數，實驗室應經常用脆弱擬桿菌ATCC25285練習，以保證技術熟練。
10.4 微量肉湯稀釋板孵育
（1） 為保證孵育溫度，微量稀釋板的疊放不應超過四層。
（2） 接種好的微量稀釋板應放在厭氧環境中35℃孵育46-48小時。
（3） 應采取措施防止微量稀釋板的蒸發。
10.5 判讀微量肉湯稀釋終點
（1） 在黑色，使用間接光無反射光的背景下觀察，放大鏡可使用。
（2） 如果生長對照孔的生長微弱或不生長，則不應判讀。<
